Основу музейного собрания заложили коллекции национализированных окрестных усадеб (Петровское, Борисоглеб и Иловна, Сосновец, Тихвино-Никольское). В 1920-1930-х гг. их дополнили произведения искусства из столичных собраний, коллекции ликвидированных Мышкинского, Пошехонского и Мологского музеев. На протяжении всей своей деятельности музей ведет большую собирательскую работу, привозя из экспедиций, приобретая, получая в дар экспонаты своих многочисленных коллекций. 

Значительна коллекция зарубежного искусства - самая крупная в регионе. В ней выделяется раздел западноевропейской графики XVI-XIX вв.: работы мастеров Италии (Аг. Каррачи, О.Фиалетти, С. делла Белла, Дж.Б. Галеструцци), Нидерландов (Х.Гольциус, В.Сваненбург, К.Пасс), Германии (И.Майор, Х.В.Э.Дитрих), Франции (Р.Нантейль, Ж.Эделинк, К.Жилло, Ф.Буше) и Англии (Ф.Бартолоцци, Р.Ирлом, В.Грин). В разделе западноевропейской живописи наиболее полно представлены нидерландская, французская, немецкая и итальянская школы. Особого упоминания заслуживают произведения Б.Бренберга, Я.ван Хейсума, М. де Хондекутера, Х. ван Хове и А.Эдельфельта. В разделе западноевропейской скульптуры XVIII - XIX вв. выделяются работы П.Ф.Томира, Клодиона, А.Л.Бари, К.Фратэна. 

Коллекция зарубежного прикладного искусства включает образцы продукции ведущих керамических центров Европы: майолики Фаэнцы, Губбио, Урбино, Кастелли, Савоны и Генуи ХVI - пер. пол. XVIII вв.; полуфаянсы Авона кон. XVI - XVII вв.; фаянсы Руана, Делфта, Страсбурга кон. XVII - XVIII вв.; образцы немецкой керамики, каменный товар и фаянсы Веджвуда. Художественный фарфор представлен изделиями Мейсенской и Севрской (XVIII - нач. XIX вв.), Берлинской (XIX в.), Нимфенбургской и Копенгагенской (кон. XIX - нач. XXвв.) фарфоровых мануфактур. В разделе керамики стран Востока выделяются китайский фарфор эпох Цин и Мин, предметы японской керамики Сацума и Банко, образцы персидской и туркестанской керамики XIII, XVI - XIX вв., силезское и богемское стекло XVIII - XIX вв. Есть ценные образцы художественной обработки металла, мебель, дальневосточная резная кость, ткани, нумизматика. 

Русская православная культура представлена коллекциями меднолитой пластики XI - XIX вв., книг кириллической печати XVII - XIX вв., иконописи, включающей как образцы древнерусского искусства XVI - XVII вв. («Спас оплечный», «Видение Иоанна Лествичника со сценами жития»; «Богоматерь Киккская» кисти Леонтия Тюменева), так и многочисленные произведения XVIII - нач. XX вв., изделиями в технике финифти, резьбой по дереву. 

Собрание русского изобразительного искусства дает полное представление о его развитии в ХVIII - XX вв. Портретная живопись XVIII в. включает работы и ведущих мастеров этого жанра (И.Я.Вишняков, Ф.С.Рокотов, К.Л.Христинек), и менее известных авторов (Н.Абхази, Е.Д.Камеженков), а также провинциальных художников (А.Чащин, И.В.Шляхтенков). Первая половина XIX в. наряду с работами Ф.М.Матвеева и А.Г.Варнека представлена яркими образцами т.н. «купеческого портрета» (И.В.Баженов, И.В.Тарханов). Творчество мастеров середины - второй половины XIX в. представлено работами И.К.Айвазовского, А.П.Боголюбова, В.В.Верещагина, К.Е.Маковского, А.А.Харламова, И.И.Шишкина. В коллекции русской живописи нач. ХХ в. - произведения С.Ю.Жуковского, П.П.Кончаловского, И.И.Бродского, собрание работ И.С.Далматова. Послереволюционный период представлен работами Р.Р.Френца, З.Н.Серебряковой, К.Н.Бритова, А.В.Учаева, местных художников (В.В.Трамзин, В.В.Тулин, Н.Д.Малафеев). 

В коллекции русской графики XVIII-XX вв. - произведения А.Н.Бенуа, В.И.Гау, И.Н.Крамского, В.В.Пукирева, И.Е.Репина, Н.Е.Сверчкова, Г.И.Семирадского, Н.К.Рериха, С.В.Чехонина, гравюры П. Пикарта, Е.П.Чемесова, Г.И.Скородумова, И.И.Шишкина. В разделе современной графики многочисленны работы рыбинских художников: от 20-х гг. (П.Т.Горбунцов, Т.И.Миссарин) до наших дней (М.П.Соловьев, С.В.Стукалин, В.А.Цаплин); выделяется значительное собрание работ Кукрыниксов, подаренное музею одним из авторов - Н.А.Соколовым. 

В собрании русского прикладного искусства XVIII-XIX вв. наиболее значительны коллекции фарфора (изделия ИФЗ, заводов Гарднера, Попова, Батенина, продукция небольших заводов - в том числе местного, в п.Песочное) и стекла (изделия ИСЗ, завода Бахметева, в т.ч. А. И. Вершинина). 

Художественная и историческая части коллекции во многом взаимосвязаны. В собрании сложились значительные комплексы поступлений из усадеб Михалковых, Мусиных-Пушкиных, Лихачевых, включающие, наряду с документами и бытовыми предметами XVIII - XIX вв., и уникальные произведения искусства - фрагменты художественных коллекций, портреты из усадебных галерей. 

Произведения народного искусства (пряничные доски, прялки, предметы народного костюма) в значительной степени составляют коллекцию изделий крестьянского быта XVIII - нач. XX вв. 

Коллекции по истории города и края, персональные фонды земляков включают документы, фотографии, предметы быта и прочее. 

Фонд археологии, пополняемый материалами из археологических раскопок домонгольского поселения Усть-Шексна, расположенного на территории современного города, включает предметы деятельности человека на территории края, начиная с древнейших времен. 

В коллекции флоры и фауны края – чучела животных и птиц, ископаемые формы растений и животных. Среди последних специалисты выделяют отпечатки древних папоротников и плаунов, ископаемые остатки головоногих моллюсков (аммониты и белемниты), а также других древних беспозвоночных, отпечатки рыб, череп панцирноголового земноводного (тоозуха), части скелета мамонта, черепа первобытных бизонов и шерстистого носорога.